Genómica analítica y traslacional
El Recurso Compartido de Genómica Analítica y Traslacional (ATG) proporciona secuenciación de próxima generación y otros servicios relacionados con la genómica a los miembros del Centro de Cáncer de la UNM y otros usuarios de la UNM e instituciones afiliadas. Los servicios principales implican la secuenciación de próxima generación, utilizando los dos instrumentos Ion Proton S5/XL y el soporte bioinformático experto asociado. Estos incluyen RNA-seq 'a granel' regular, RNA-seq de una sola célula usando el sistema 10x Genomics, secuenciación de ADN dirigida, ChIP-seq y una variedad de otros ensayos, muchos de los cuales se pueden realizar con células o tejidos vivos o congelados. o muestras archivadas (por ejemplo, FFPE). El secuenciador G4 de Singular Genomics proporciona secuenciación de próxima generación en un formato flexible y rápido adecuado para todo tipo de ensayos de RNA-seq y DNA-seq. Los instrumentos Ion Proton S5/XL son especialmente adecuados para analizar ARN de mala calidad, por ejemplo, de material FFPE, que son difíciles o imposibles de analizar con otras tecnologías. Los instrumentos generan hasta 100 millones de lecturas por chip de secuenciación, y nos esforzamos por proporcionar una respuesta rápida, si es posible.
El recurso compartido cuenta con el apoyo del UNM Cancer Center, incluida la subvención básica del CCSG P30CA118100 y otros fondos, así como con fondos del estado de NM y tarifas de usuario.
El personal experto está disponible para consultas para ayudar a los usuarios a diseñar los mejores experimentos posibles, para maximizar la calidad de los datos que se producen.
Director de la facultad
Scott A. Ness, Ph.D.
Maestro, Medicina Interna/ Medicina molecular
Despacho: CRF 121; Tel: (505) 272-9883
Director Técnico / Bioinformática
Kathryn (Charlie) Brayer, Doctora en Filosofía
Personal técnico superior
cocinero kel CRF 118 Teléfono: (505) 272-5564
Jennifer Woods CRF 121 Teléfono: (505) 272-3464
Cifrado de Maggie CRF 121 Teléfono: (505) 272-2464
Genómica analítica y traslacional
ATG está disponible para que lo utilicen todos los investigadores de la UNM y las instituciones afiliadas.
Para reconocer el uso de este recurso compartido, incluya lo siguiente en sus publicaciones:
Esta investigación fue parcialmente financiada por la Subvención de Apoyo al Centro Integral del Cáncer de la UNM NCI P30CA118100 y utilizó el recurso compartido de genómica analítica y traslacional, que recibe apoyo adicional del estado de Nuevo México.
Los servicios de ATG se describen con más detalle a continuación.
El Recurso de genómica analítica y traslacional proporciona principalmente tecnologías de secuenciación de próxima generación como RNA-seq, secuenciación de panel de genes específicos y ensayos epigenéticos como ChIP-seq y ATAC-seq, junto con análisis bioinformáticos expertos. Los servicios de PCR en tiempo real también están disponibles. El recurso compartido de ATG está disponible para que lo usen todos los profesores de la UNM y sus afiliados, y se recomienda a todos los investigadores que se comuniquen con nosotros para averiguar cómo podemos ayudarlos con su investigación.
Secuenciación de una sola célula genómica 10x: Se ofrece secuenciación unicelular de última generación mediante el sistema 10x Genomics, que funciona bien con células vivas o con núcleos aislados de muestras congeladas.
Secuenciación de dos extremos de Singular Genomics G4: Un instrumento de secuenciación flexible y rápido para todos los tipos de secuenciación de próxima generación, incluidos RNA-seq, ChIP-seq, secuenciación de exoma completo (WES) o secuenciación de genoma completo (WGS). La mayoría de las bibliotecas preparadas para la secuenciación de Illumina se pueden convertir de manera rápida y eficiente para su análisis en el G4.
Secuenciación de Illumina: ATG tiene un contrato con Genomics Core en Univ of CO, Anschutz para la secuenciación de Illumina utilizando su instrumento NovaSeq. ATG puede preparar bibliotecas y enviarlas a UofCO para secuenciación, o enviar muestras allí para preparación y secuenciación de bibliotecas. Posteriormente, los datos se cargan en nuestra cuenta web de AWS para el análisis de datos.
Secuenciación de próxima generación de Ion Torrent: Los potentes instrumentos de secuenciación de semiconductores Ion Proton S5/XL de Life Technologies son ideales para los ensayos de secuenciación de última generación, incluidos los ensayos de expresión génica (RNA-seq), los ensayos epigenéticos (ChIP-seq) y la secuenciación dirigida (Ion Ampliseq Comprehensive Cancer Panel) de cáncer- genes relevantes, incluso de muestras FFPE.
Análisis de datos expertos en bioinformática: El personal de recursos compartidos de ATG utiliza métodos sofisticados de análisis de datos para analizar la expresión génica y los datos de genotipado y se esfuerza por proporcionar a nuestros usuarios cifras con calidad de publicación para sus manuscritos o solicitudes de subvenciones. Usamos paquetes de software R/Bioconductor para explorar los grandes y complicados conjuntos de datos generados por métodos genómicos.
Aplicaciones de la secuenciación de próxima generación
La secuenciación de próxima generación (masivamente paralela) es útil para una variedad de enfoques experimentales. No reemplaza la secuenciación normal (Sanger) de plásmidos o productos de PCR. En cambio, la secuenciación de próxima generación se basa en capturar millones o miles de millones de moléculas de ADN individuales (por ejemplo, fragmentos de ADN genómico, ADNc), que luego se amplifican por separado y se secuencian en paralelo, generando millones o miles de millones de "lecturas" de secuenciación, cada una de las cuales se originó a partir de una molécula de plantilla diferente. Es similar a la clonación y secuenciación individual de millones o miles de millones de fragmentos de ADN independientes, pero todo sucede a la vez y en tan solo unos días.
Los siguientes tipos de aplicaciones científicas se adaptan fácilmente a los enfoques de secuenciación de próxima generación:
- Secuenciación de panel de genes dirigidos de genes relevantes para el cáncer o la enfermedad
- Estudios de expresión génica mediante RNA-seq
- Inmunoprecipitación de cromatina: secuenciación (ChIP-seq) para factores de transcripción o estudios epigenéticos
- Estudios de metilación de ADN (por ejemplo, RRBS)
- Secuenciación de transcriptomas (p. Ej., Identificación de ARN con especias alternativas)
- Análisis de ARN no codificantes (ncRNA, lincRNA, miR)
La instalación de ATG actualmente tiene o tiene acceso a varios tipos de instrumentos de secuenciación de próxima generación:
- Genómica singular G4: Secuenciación emparejada rápida y flexible (similar a Illumina NextSeq)
- TermoFisher Ion S5/XL: NGS de estado sólido que genera hasta 120 millones de lecturas por chip
- Secuenciación de iluminación (NovaSeq y NextSeq) a través de nuestros socios en Univ of CO, Anschutz
- Controlador de cromo 10x Genomics: para ensayos de RNA-seq y ATAC-seq unicelulares
Estos instrumentos proporcionan una secuenciación de próxima generación rápida y rentable para todos los tipos de ensayos de secuenciación de próxima generación.
Instrumentos compartidos disponibles de lunes a viernes de 8:30 am a 5 pm
(otras horas pueden estar disponibles por acuerdo especial)
ATG tiene varios instrumentos únicos que los investigadores de la UNM pueden organizar para usar. Los laboratorios calificados pagan una tarifa de usuario anual y reciben capacitación y apoyo del personal de ATG. Los instrumentos están disponibles para su uso en la instalación durante el horario normal de trabajo.
Bioanalizador Agilent: Un instrumento importante para los biólogos moleculares, reemplaza la electroforesis en gel para muchos tipos de aplicaciones. Es especialmente útil para analizar la calidad y / o cantidad de muestras de ARN o ADN utilizando cantidades muy pequeñas de material, en lugar de procesar grandes cantidades de muestras preciosas en un gel.
Espectrofotómetro Nanodrop: Espectrofotómetro de gotas que mide la absorbancia en una pequeña gota de muestra. Esto evita la necesidad de diluir muestras en cubetas grandes.
Thermo Fisher Cell Cotess II: para cuantificar células vivas en una muestra.
Disociador Milteny gentleMACS Octo con calentadores: Para disociar muestras de tejido antes de la secuenciación.
Fluorómetro Qubit: para la cuantificación de ARN y ADN
Comuníquese con el personal de las instalaciones de ATG para obtener más información sobre ensayos y precios.
Utilice nuestro sitio iLab para reservas y cotizaciones. (Necesario iniciar sesión)
El recurso compartido de genómica analítica y traslacional (ATG) (anteriormente Keck-UNM Genomics Resource, KUGR) proporciona acceso a ensayos de secuenciación de próxima generación, microarrays y otras tecnologías genómicas junto con análisis bioinformáticos expertos. ATG está disponible para que lo utilicen todos los profesores de la UNM y sus afiliados, y se anima a todos los investigadores a que se pongan en contacto con ATG para averiguar cómo podemos ayudar con su investigación.
Para preguntas sobre iLabs o para la configuración de cuenta/PR para su uso en el recurso compartido, Por favor enviar un correo electrónico a Mary Sherman o llame al 505-272-4539.
Llene el este formulario de hoja inteligente para poner en marcha tu proyecto.
(El formulario se abrirá en una nueva pestaña. Si no es así, copie y pegue este texto en la barra de direcciones de una nueva pestaña en su navegador: https://app.smartsheet.com/b/form/fa518ed260454445bec9d3bc34cac4cf)
Preguntas frecuentes de ATG
Estas son pautas para los investigadores que contemplan el uso de los servicios de secuenciación de próxima generación (NGS) del recurso compartido de ATG. Se insta a todos los investigadores a consultar con el personal de ATG antes de comenzar a preparar o analizar muestras. Podemos ayudarlo con el diseño experimental y, si es necesario, ponerlo en contacto con expertos en bioestadística que pueden ayudarlo con el diseño experimental. Es muy importante considerar el diseño experimental antes de comenzar los experimentos NGS, que pueden ser bastante costosos.
La secuencia de ARN se puede realizar con éxito con cantidades muy pequeñas de ARN. Sin embargo, la cantidad requerida depende de la "profundidad de lectura" requerida y si habrá contaminación por ARN ribosómico. El ARN ribosómico es el 90% del ARN en las células, por lo que es necesario eliminar o reducir el ARN ribosómico antes de realizar la secuencia de ARN. Las dos formas de hacer esto son la eliminación física, a través de "Ribodepleción", en la que las sondas biotiniladas complementarias a los ARN ribosomales se hibridan con las muestras de ARN, luego los complejos se capturan y eliminan. Alternativamente, se puede usar un método de preparación de bibliotecas dirigido a poli-A (por ejemplo, Smart-Seq) que evita la secuenciación del ARN ribosómico, pero que excluye otros ARN que carecen de colas de poliA y que podrían ser de interés (por ejemplo, microARN). Comuníquese con el personal de recursos compartidos de ATG para discutir las opciones antes de comenzar los experimentos.
El recurso compartido de ATG realiza un análisis NGS de servicio completo. Sin embargo, debido a las complejidades de la preparación de la biblioteca NGS, lo que ATG puede proporcionar depende del tipo de experimento. Para la secuenciación de panel dirigida y la secuenciación del exoma, solo necesitamos muestras de ADN y produciremos las bibliotecas, realizaremos la secuenciación y el análisis inicial. Proporcionaremos una cotización por el costo esperado antes de comenzar el trabajo. Para RNA-seq y otros enfoques, existen muchas variaciones en la forma en que se pueden construir las bibliotecas. Instamos a los usuarios a que se comuniquen con el personal de ATG para discutir las opciones antes de comenzar. Además del sistema completo Affymetrix, el ATG Shared Resource tiene un espectrómetro Nanodrop para cuantificar ARN en pequeños volúmenes y un bioanalizador Agilent para analizar rápidamente la calidad y cantidad de muestras de ARN o ADN.
Los experimentos de NGS pueden resultar costosos. El costo total para la mayoría de los experimentos grandes (secuenciación del exoma, RNA-seq, etc.) es de $ 500 a $ 800 por muestra, más un cargo por bioinformática. Algunos experimentos de secuenciación específicos más pequeños cuestan menos por muestra. Comuníquese con el personal para obtener más información y una cotización.
¡Sí! Los experimentos de NGS generan conjuntos de datos grandes y complejos. El análisis bioinformático no es posible sin duplicados. Los triplicados son mejores. Las réplicas son realmente necesarias para obtener buenos resultados que sean significativos y que valgan la pena.
El recurso compartido de ATG sigue estrictas pautas de control de calidad y procedimientos operativos estándar para garantizar que los datos sean de la más alta calidad y cumplan o superen los estándares establecidos por grupos como el consorcio ENCODE. Usamos controles de aumento estándar para monitorear los procesos internos y realizar verificaciones de control de calidad en cada etapa de la producción y secuenciación de la biblioteca. Comuníquese con el personal de ATG para ver ejemplos de los datos que hemos producido con éxito.
La calidad de las muestras de ARN iniciales se confirmará mediante el Agilent BioAnalyzer o mediante PCR en tiempo real. Las bibliotecas se comprobarán de forma similar antes de la secuenciación. Se agregan controles de aumento en varios pasos para monitorear el control de calidad interno.
Los ensayos NGS producen conjuntos de datos grandes y complejos que contienen enormes cantidades de información, pero también pueden ser difíciles de analizar. El recurso compartido de ATG proporciona el primer nivel de análisis, incluido el análisis de los parámetros de control de calidad, la alineación de las lecturas con el genoma apropiado, la identificación de variantes de secuencia o recuentos de características, según corresponda, y la realización de tipos de interpretación sencillos, como la producción de mapas de calor. para RNA-seq. Sin embargo, los tipos más complicados de análisis de datos, como la correlación de los resultados con la información del paciente, deben realizarse con el aporte de expertos del recurso compartido de bioinformática o del recurso compartido de bioestadística. El personal de ATG puede ayudar a establecer interacciones con los expertos adecuados, que deben participar desde el principio para ayudar con el diseño experimental y el control de calidad.
Existe la posibilidad de que el complejo proceso involucrado en la generación de datos NGS produzca un "efecto de día" o "efecto de lote", en el que las muestras procesadas o analizadas en los mismos datos se agrupan. Este es un artefacto bien conocido del análisis de datos de alta dimensión, e incluimos controles de aumento para ayudarnos a identificar y eliminar este tipo de problemas de datos.
El recurso compartido de ATG cuenta con un equipo de expertos en bioinformática que realizarán el análisis de datos inicial y que gestionarán y realizarán copias de seguridad de los datos. Pueden realizar los tipos de análisis más sencillos (por ejemplo, expresión génica de RNA-seq). Sin embargo, los tipos de análisis complejos o personalizados requerirán aportaciones de expertos adicionales de los Recursos Compartidos de Bioestadística o Bioinformática. El personal de ATG puede ayudar a establecer las colaboraciones necesarias.
La verificación es una parte importante de cada experimento NGS y los requisitos varían según el tipo de experimento. Comuníquese con el personal de ATG para analizar las opciones para verificar los resultados de NGS.
El director de la instalación, Scott A. Ness, doctorado., puede proporcionar cartas de apoyo y consejos sobre cómo describir el recurso compartido de ATG y los posibles experimentos de NGS en las solicitudes de subvenciones. El Dr. Ness ha trabajado en numerosas secciones de estudio de NIH, ACS y DOD y ha revisado muchas solicitudes de subvenciones que incluyen experimentos de NGS. Sus propias subvenciones financiadas tienen experimentos de NGS. Él puede ayudarlo a escribir secciones de su subvención con respecto a los experimentos de NGS y puede señalar posibles escollos y cosas que se deben evitar.
La forma más fácil de criticar un experimento NGS es describirlo como una expedición de pesca. Aquí hay algunas cosas que definitivamente debes evitar.
- No se proponga caracterizar genes que aún no haya identificado. Si no tiene datos preliminares, no sabe qué genes o cuántos genes encontrará. Sin embargo, es probable que asciendan a cientos. Decir simplemente que escogerá algunos genes interesantes para estudiar es una forma rápida de obtener una mala puntuación en su subvención. Si es posible, su experimento debe probar una hipótesis. Por ejemplo, puede hacer la hipótesis de que ciertos genes (por ejemplo, genes de apoptosis) serán inducidos. Luego, puede proponer el uso de ensayos NGS para probar eso (y proponer la PCR en tiempo real como un enfoque de respaldo). De esa manera, puede probar una hipótesis, proponer resultados y controles esperados (por ejemplo, genes que deberían subir y bajar), que es una forma mucho mejor de hacer un experimento NGS (o cualquier otro experimento). Simplemente ir a pescar genes es un mal enfoque y siempre atrae la ira del comité de revisión.
- Decir simplemente que utilizará algún programa de software para analizar los datos o agrupar los genes en rutas también le traerá problemas. Los datos NGS pueden ser extremadamente complejos y requerirán métodos estadísticos para su análisis. Los datos de la vía que se conocen son lamentablemente incompletos. De todos modos, la mayoría de los genes no están en las vías. Necesitará un enfoque bien planificado para analizar los datos. Debería tener una forma de saber si el experimento funcionó o no (por ejemplo, ¿se activaron los genes de apoptosis esperados?).
- El experimento NGS no debe ser simplemente un párrafo al final de uno de sus objetivos. Hagas lo que hagas, absolutamente no añadas un experimento de NGS al final de una solicitud de subvención como algo que "también harás". Los experimentos de NGS son grandes, costosos y complicados y no se pueden hacer como una ocurrencia tardía. Muchas, muchas subvenciones tienen una descripción de un párrafo de un experimento NGS que los investigadores también harán. Eso es un pararrayos para las críticas de los críticos.
- Si está buscando genes, debería buscarlos por una razón. No proponga simplemente buscar genes regulados sin proponer hacer algo con ellos. Encontrar los genes que suben y bajan no es un objetivo lo suficientemente importante. Debe buscar genes con algún propósito en mente (por ejemplo, alguna hipótesis para probar).